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WB內(nèi)參抗體選擇指南

內(nèi)參是什么？

內(nèi)參是一種特異識(shí)別高表達(dá)或普遍表達(dá)蛋白的抗體，在western blot中用于校正蛋白水平。

什么情況下需要用內(nèi)參抗體?
1. 定量比較：對(duì)比不同點(diǎn)樣孔間信號(hào)的時(shí)候，內(nèi)參是必須的。只有各孔間內(nèi)參的表達(dá)量相同，目標(biāo)蛋白表達(dá)量的變化才是可信的。
2. 上樣和轉(zhuǎn)移確認(rèn)：內(nèi)參可以確認(rèn)是否所有的樣品都加入及各孔間的轉(zhuǎn)移量是否相等。通過(guò)分析內(nèi)參信號(hào)可以確定蛋白從膠轉(zhuǎn)移到膜上是否均一。
3. 研究發(fā)表：大部分雜志要求做WB實(shí)驗(yàn)時(shí)提供內(nèi)參數(shù)據(jù)，來(lái)確保實(shí)驗(yàn)樣本中差異表達(dá)量是可信的。內(nèi)參可以校正各孔間目的蛋白的表達(dá)量。

在內(nèi)參抗體的選擇過(guò)程中一般遵循以下原則：

首先要考慮的就是實(shí)驗(yàn)樣本來(lái)源于什么物種。
1、哺乳動(dòng)物的組織或者細(xì)胞樣本，通常選擇β-actin、β-tubulin、GAPDH、Lamin B、Histone H3、Na,K -ATPase等。
2、植物來(lái)源實(shí)驗(yàn)樣本，則可以選擇plant actin、Rubisco等。
3、其他來(lái)源樣本研究較少，所以就應(yīng)該參照文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，選擇合適的蛋白作為內(nèi)參。

蛋白分子量
選擇內(nèi)參抗體時(shí)，應(yīng)該考慮目的蛋白分子量的大小。通常應(yīng)該保證目的蛋白與內(nèi)參蛋白分子量相差5KD以上。比如目的蛋白分子45KD，此時(shí)不適宜選擇β-actin作為內(nèi)參，可以考慮選擇GAPDH或者β-tubulin作為內(nèi)參。

目的蛋白表達(dá)部位
就一般的蛋白檢測(cè)來(lái)說(shuō)，β-actin、β-Tubulin抗體等就可以了，而針對(duì)于核蛋白的定量，特別是樣本蛋白就是核蛋白時(shí)，選擇恰當(dāng)?shù)暮说鞍變?nèi)參則更能體現(xiàn)內(nèi)部參照的價(jià)值。
常用的核內(nèi)參抗體有Lamin A、Lamin B、Histone H3，除此之外，其它常見(jiàn)的核蛋白內(nèi)參還有PCNA、K70、K80等，在一些文獻(xiàn)報(bào)道中，Erk2、TATA binding protein(TBP)以及c-Jun、c-Fos等都有使用。
而對(duì)于膜蛋白檢測(cè)，常用的內(nèi)參抗體為Na,K ATPase。
對(duì)于線粒體蛋白的檢測(cè)，常用VDAC1和COX IV作為內(nèi)參抗體。
以上幾條原則只是針對(duì)通常情況，但是需要注意的問(wèn)題是——內(nèi)參的選擇需要考慮實(shí)際的實(shí)驗(yàn)環(huán)境。
比如某些細(xì)胞中，由于組織缺氧、糖尿病等因素會(huì)導(dǎo)致GAPDH的表達(dá)增高，不適合做內(nèi)參。
比如在涉及細(xì)胞增殖相關(guān)試驗(yàn)中，c-Jun由于自身表達(dá)變化就不適合做內(nèi)參;而在凋亡實(shí)驗(yàn)時(shí)，TBP、Lamin等也不適合作為內(nèi)參。
因此設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案的時(shí)候應(yīng)該考慮這些因素并查詢(xún)相應(yīng)文獻(xiàn)，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中也應(yīng)該注意如果內(nèi)參表達(dá)出現(xiàn)異常，應(yīng)考慮這方面因素。

常見(jiàn)內(nèi)參：

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